Ia. Clonaje en un vector de expresión bacteriano (1 tag)

Amplificación/Aislamiento del Marco Abierto de Lectura (ORF) a partir del vector suministrado por el cliente y subclonaje en el vector de expresión bacteriano seleccionado. Análisis de los clones positivos. Confirmación de la integridad del DNA clonado por secuenciación empleando oligonucleótidos cebadores sentido y antisentido específicos para cada vector. Preparación del vector recombinante a partir de 10 ml de cultivo bacteriano.

IIa. Ensayo de expresión a pequeña escala (1 tag)

Transformación del DNA recombinante en una línea apropiada de E. coli, deficiente en proteasas (ej: BL21). Evaluación de la expresión de proteína a pequeña escala a partir de 50 ml de cultivo bacteriano a dos temperaturas (37ºC y 16ºC). Análisis de sobreexpresión de la proteína de interés por SDS-PAGE, Western Blot con anticuerpos anti-tag o bien un anticuerpo específico suministrado por el cliente y/o confirmación por Espectrometría de Masas (MALDI-TOF)

III. Producción a gran escala

Crecimiento de un litro de cultivo bacteriano a la temperatura adecuada. Inducción con IPTG y recolección del cultivo. Las pastillas o pellets celulares serán congelados y luego enviados al cliente o podrán ser utilizados en la fase de purificación.

IVa. Purificación de proteínas recombinantes solubles

Lisis de las células inducidas. Cromatografía de afinidad de la proteína de interés en la fracción soluble utilizando resinas de afinidad específicas para proteínas fusionadas con 6xHis, GST o MBP. Diálisis de la proteína purificada en tampones estándar o soluciones especificadas por el cliente. Concentración de la proteína purificada.

IVb. Purificación de proteínas fusionadas a His insolubles

Lisis de las células inducidas. Aislamiento de los cuerpos de inclusión. Desdoblamiento de la proteína de interés con agentes desnaturalizantes. Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados (IMAC) de la proteína desnaturalizada y posterior renaturalización en columna. Diálisis de la proteína purificada en tampones estándar o soluciones especificadas por el cliente. Concentración de la proteína purificada.