I. Clonaje en vector de expresión de mamíferos

Amplificación/Aislamiento del Marco Abierto de Lectura (ORF) a partir del vector suministrado por el cliente y subclonaje en el vector de expresión de mamíferos seleccionado. Análisis de los clones positivos. Confirmación de la integridad del DNA clonado por secuenciación empleando oligonucleótidos cebadores sentido y antisentido específicos para el vector. Preparación del vector recombinante a partir de 100 ml de cultivo bacteriano.

II. Ensayo de expresión a pequeña escala

Transfección del vector recombinante en 10⁷ células de mamífero para su expresión transitoria. Recolección y lisis de las células tras 4-5 días. Evaluación de la expresión recombinante por SDS-PAGE, Western Blot con anticuerpos anti-tag o bien un anticuerpo específico suministrado por el cliente y/o confirmación por Espectrometría de Masas (MALDI-TOF).

III. Producción a media escala

Transfección del vector recombinante en 10⁸ células de mamífero para su expresión transitoria. Recolección de las células tras 4-5 días. La pastilla o pellet de células, o bien el sobrenadante si la proteína es secretada, será congelado y enviado al cliente o podrá ser utilizado en la fase de purificación.

IVa. Purificación de proteínas recombinantes solubles

Lisis de las células transfectadas. Cromatografía de afinidad de la proteína de interés en la fracción soluble utilizando resinas de afinidad específicas para proteínas fusionadas con 6xHis. Diálisis de la proteína purificada en tampones estándar o soluciones especificadas por el cliente. Concentración de la proteína purificada.

IVb. Purificación de proteínas fusionadas a His insolubles

Lisis de las células transfectadas. Desdoblamiento de la proteína de interés con agentes desnaturalizantes. Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados (IMAC) de la proteína desnaturalizada y posterior renaturalización en columna. Diálisis de la proteína purificada en tampones estándar o soluciones especificadas por el cliente. Concentración de la proteína purificada.