Ia. Clonaje en un vector de expresión de baculovirus (1 tag)

Amplificación/Aislamiento del Marco Abierto de Lectura (ORF) a partir del vector suministrado por el cliente y subclonaje en el vector de expresión de baculovirus seleccionado. Análisis de los clones positivos. Confirmación de la integridad del DNA clonado por secuenciación empleando oligonucleótidos cebadores sentido y antisentido específicos para el vector. Preparación del vector recombinante a partir de 100 ml de cultivo bacteriano.

IIa. Generación de baculovirus recombinante (1 tag)

Transfección de células de insecto Sf9 con el vector de expresión en baculovirus. Aislamiento y purificación en placa de tres clones recombinantes de baculovirus. Análisis a pequeña escala de la sobreexpresión de la proteína de interés por SDS-PAGE, Western Blot con anticuerpos anti-tag o bien un anticuerpo específico suministrado por el cliente y/o confirmación por Espectrometría de Masas (MALDI-TOF).

III. Amplificación de baculovirus recombinantes para stock de título elevado

Generación de 250 ml de stock de alto título viral a partir de la solución reserva de bajo título viral (el volumen mínimo requerido es de 5 ml. Si el título del virus seleccionado es demasiado bajo se podrán requerir rondas de amplificación del virus). Determinación del título por dilución a punto final.

IV. Optimización de la expresión

El stock de baculovirus recombinantes de título elevado se utilizará para determinar las mejores condiciones de expresión de proteína en relación a la multiplicidad de infección (1, 5 o 10), el tiempo de recolección (48, 72 o 96hs) y temperatura (27º o 22 ºC)

V. Producción a gran escala

Infección de 500 ml de cultivo de células de insecto bajo las condiciones optimizadas. La pastilla o pellet de células, o bien el sobrenadante si la proteína es secretada, será congelado y enviado al cliente, o podrá será utilizado en la fase de purificación

VIa. Purificación de proteínas recombinantes solubles

Lisis de las células infectadas. Cromatografía de afinidad de la proteína de interés en la fracción soluble utilizando resinas de afinidad específicas para proteínas fusionadas con 6xHis o GST. Diálisis de la proteína purificada en tampones estándar o soluciones especificadas por el cliente. Concentración de la proteína purificada.

VIb. Purificación de proteínas fusionadas a His insolubles

Lisis de las células infectadas. Desdoblamiento de la proteína de interés con agentes desnaturalizantes. Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados (IMAC) de la proteína desnaturalizada y posterior renaturalización en columna. Diálisis de la proteína purificada en tampones estándar o soluciones especificadas por el clieoncentración de la proteína purificada.