I. Selección del iFrag por análisis bioinformático

Algoritmos para análisis de secuencias y selección de las regiones de proteína (iFrag) más adecuadas.

IIa. Clonaje en un vector de expresión bacteriano con 6xHis

Diseño de oligonucleótidos cebadores. Amplificación del fragmento a partir del vector suministrado por el cliente y subClonaje en el vector de expresión bacteriano seleccionado. Análisis de los clones positivos. Confirmación de la integridad del DNA clonado por secuenciación empleando oligonucleótidos cebadores sentido y antisentido específicos para el vector. Preparación del vector recombinante a partir de 10 ml de cultivo bacteriano.

IIb. Síntesis de la región codificante del iFrag y clonaje en el vector de expresión bacteriano etiquetado con His

Diseño de oligonucleótidos que solapen y cubran la región codificante del iFrag. Síntesis de la región codificante iFrag y subclonaje en el vector de expresión bacteriano seleccionado. Análisis de los clones positivos. Confirmación de la integridad del DNA clonado por secuenciación empleando oligonucleótidos cebadores sentido y antisentido específicos para el vector. Preparación del vector recombinante a partir de 10 ml de cultivo bacteriano.

III. Ensayo de expresión a pequeña escala

Transformación del DNA recombinante en una línea apropiada de E. coli, deficiente en proteasas (ej: BL21). Evaluación de la expresión de proteína a pequeña escala a partir de 50 ml de cultivo bacteriano. Análisis de sobreexpresión del iFrag por SDS-PAGE, Western Blot con anticuerpo anti-6xHis y/o confirmación por Espectrometría de Masas (MALDI-TOF).

IV. Producción a gran escala

Crecimiento de un litro de cultivo bacteriano. Inducción con IPTG y recolección del cultivo. Las pastillas o pellets celulares serán congelados y luego enviados al cliente o podrán ser utilizados en la fase de purificación.

V. Purificación del iFrag en condiciones desnaturalizantes

Lisis de las células inducidas. Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados (IMAC) de los extractos celulares en condiciones desnaturalizantes. Preparación de las muestras para inoculación.